ОЛИГОПЕПТИДЫ № 24

Состав: пептидный пул для оздоровления, укрепления, и лечения болезней мышц.

Применяется для набора мышечной массы у спортсменов и пожилых людей при саркопении, а также людям с дефицитом массы тела.

У молодых людей с дефицитом роста комплекс №24 способствует:
— нормализации роста и достижению конечного роста в пределах или выше генетически прогнозируемого;
— нормализации состава тела;
— повышению минеральной плотности костей и уменьшению риска возникновения переломов;
— нормализации метаболических процессов;
— снижению факторов риска развития сердечно-сосудистых осложнений;
— нормализации репродуктивной функции;
— нормализации психологического состояния и жизненного тонуса.
Комплекс №24 – эффективный препарат у профессионалов и любителей спорта. Он лишен побочных эффектов, связанных с многими препаратами, включая гормон роста.

Комплекс №24 ускоряет выработку факторов роста и мышечную массу, а также активно регулирует метаболизм костной и жировой ткани организма.
Комплекс №24 угнетает активность ферментов, оказывающих разрушающее действие на аминокислоты. Также регулирует синтез коллагена в костной ткани и коже. Комплекс №24 увеличивает размер и количество клеток щитовидной железы, надпочечников, печени, половых желез, вилочковой железы и мышц.
Еще комплекс №24 действует на распад жиров.

Пептидный пул комплекса №24 препятствует развитию большого количества разрушительных процессов в организме человека и стимулирует восстановительные. Под действием комплекса №24 происходит омоложение организма на 10-20 лет.
Под действием комплекса №24 происходит:
— анаболический эффект за счет роста мышечной массы;
— уменьшения жировых отложений;
— укрепляется костная система;
— жировые отложения преобразуются в мышцы;
— усиливается иммунитет;
— повышаются умственные способности;
— снижается уровень холестерина в крови;
— увеличивается сексуальная активность.
Помимо влияния на рост мышц, комплекс №24 активизирует физическую и психическую деятельность организма в целом, повышается концентрация внимания, снижается чувство усталости, создается ощущение «Я могу все».
Комплекс №24 не имеет побочных эффектов и не вызывает привыкания.
Комплекс №24 принудительно активирует ТАК1 посредством влияния на сверхэкспрессию белков ТАК1 и ТАВ1, что вызывает гипертрофию мышц и синтез белка. Происходит гипертрофия миофибрилл. ТАК1 стимулирует механизм трансляции белка в скелетных мышцах. ТАК1 взаимодействует с Smad1 при денервации для предотвращения чрезмерной атрофии мышц. Принудительная активация ТАК1 с помощью комплекса №24 уменьшает вызванные денервацией истощение мышц.

Супрафизиологическая активация ТАК1 способствует росту скелетных мышц и смягчает нейрогенную атрофию.

Масса скелетных мышц регулируется посредством скоординированной активации нескольких сигнальных путей. Было обнаружено, что сигналосома ТАК1 активизируется при различных состояниях мышечной атрофии и гипертрофии. Далее по тексту мы демонстрируем, что супрафизиологическая активация ТАК1 в скелетных мышцах стимулирует механизм трансляции, синтез белка и рост миофибрилл. ТАК1 вызывает фосфорилирование фактора инициации удлинения 4Е (eIF4E) независимо от mTOR. Инактивация ТАК1 нарушает морфологию нервно-мышечных соединений и вызывает нарушение регуляции передачи сигналов Smad. Используя генетические подходы, мы демонстрируем, что ТАК1 предотвращает чрезмерную потерю мышечной массы во время денервации. ТАК1 способствует ядерной транслокаци Smad4 и удержанию Smad6 в цитоплазме. ТАК1 также необходимо для фосфорилирования eIF4E в денервированных скелетных мышцах. Исследования демонстрируют, что ТАК1 поддерживает рост скелетных мышц и предотвращает нейрогенную мышечную атрофию.

Скелетные мышцы являются наиболее распространенной тканью в организме человека, которая обеспечивает мобильность, а также служит местом хранения глюкозы, липидов и белка, которые используются для производства энергии в периоды катаболизма. Масса скелетных мышц регулируется посредством скоординированной активации катаболических и анаболических путей. Ось IGF1/Akt/mTOR была предложена в качестве основного сигнального пути, который стимулирует синтез белка, что приводит к росту скелетных мышц. Активация этого пути также ингибирует атрофию мышц путем подавления экспрессии различных атрогенов. Интересно, что более поздние исследования показали, что конститутивная активация mTOR C1 вызывает атрофию скелетных мышц и миопатии, не оказывая существенного влияния на синтез белка. Например, генетическая абляция ингибитора mTOR ТSC1 (комплекс туберозного склероза 1) усугубляет вызванную денервацией атрофию. Вызванное денервацией увеличение mTOR
ингибирует Akt-киназу через механизм обратной связи, что, в свою очередь, приводит к активации факторов транскрипции О подсемейства Forkhead Box (FoxO) и увеличению экспрессии генов убиквитинлигаз Е3, MAFbx и MuRF1.
Более того, устойчивая активация mTORС1 ингибирует аутофагию в скелетных мышцах, что приводит к возникновению миопатий на более поздних стадиях. Кроме того, было обнаружено, что острая активация или подавление mTORС1 нарушает регуляцию аутофагии и нарушает гомеостаз мышечной массы в денервированной мышце. Кроме того, mTORС1 потенциально способствует возрастной атрофии мышц за счет усиления фосфорилирования STAT3 и увеличения эксперссии гена GDF15 (фактор дифференцировки роста 15).

Члены суперсемейства трансформирующих факторов роста бета (TKF- бета), которое включает подсемейство активин/миостатин/TKF-бета и подсемейство костных морфогенетических белков (ВМР), также играют важную роль в регуляции массы скелетных мышц в различных условиях. Связывание группы лигандов активин/миостатин/IGF-бета с рецепторами активина типа IIB и типа IIA (ActRIIB/IIA) и рецепторами TGF-бета TGF-бетаRII) приводит к рекрутингу и активации рецептора типа 1 активиновой рецептороподобной киназы (ALK)-4, -7 и -5.ALK 4/7 и ALK5 фосфорилируютSmad2/3, способствуя образованию мультипротеинового комплекса с со-Smad, Smad4. Затем комплекс Smad2/3 — Smad4 перемещается в ядро для регуляции экспрессии генов-мишеней Smad2/3, таких как Nodal, Pitx2, Lefty1 и Lefty2. Лиганды подсемейства BMP/GDF преимущественно связываются с комбинацией рецепторов типа II, которая включает рецептор BMP типа II(BMPRII), ActRIIa и ActRIIb, что затем приводит к привлечению рецепторов типа I, ALK3, ALK6 и ALK2. Этот компонент способствует фосфорилированию и взаимодействиюSmad1/5/8 с Smad4 для регуляции экспрессии ядерных генов. В то время какSmad4 является коактиватором, Smad6 и Smad7 отрицательно регулируют активность Smad2/3 и Smad 1/5/8.

Комплекс Smad 2/3, активируемый лигандами подсемейства активин/миостатин/TGF-бета, ингибирует рост скелетных мышц и способствует истощению скелетных мышц за счет усиления экспрессииMAFbx и MuRF1 и подавления синтеза белка. Действительно, было обнаружено, что ингибирование Smad2/3-опосредованной передачи сигналов с использованием генетических или фармакологических подходов предотвращает истощение скелетных мышц при катаболических состояниях. Недавние исследования предоставили убедительные доказательства того, что сигнальная ось BMP/Smad1/5/8 положительно регулирует массу скелетных мышц.

Принудительной активации этого пути через сверхэкспрессию BMP7 достаточно, чтобы вызвать рост скелетных мышц и уменьшить потерю массы скелетных мышц после денервации. Напротив, отсутствие GDF5/BMP14 или Smad6-опосредованной блокады оси BMP-Smad1/5/8 устраняет гипертрофию миофибрилл у людей с дефицитом миостатина и усугубляет вызванную денервацией мышечную атрофию. Следовательно, поддержание и рост массы скелетных мышц требуют синхронизированного баланса между сигналами Smad2/3 и Smad1/5/8.
TGF-бета-активируемая киназа 1 (TAK1), первоначально идентифицированная как член семейства киназ — киназ MAPK (MAP3K), является основным компонентом неканонического сигнального пути TGF-бета. Для активации TAK1 образует комплекс с адаптивным белком TAB1 и либо TAB2, либо TAB3 и претерпевает конформационные изменения, которые приводят к аутофосфорилированию Thr-187, Ser-192 в петле активации. TAK1 фосфорилирует и активирует несколько сигнальных каскадов, включая p38MAPK и JNK. TAK1 также фосфорилирует I-kарра B-киназу бета (IKK-), что приводит к активации ядерного фактора – фактора транскрипции kарра B (NF-kB). Также было обнаружено, что TAK1 регулирует каноническую передачу сигналов TGF-бета в некоторых типах клеток. Например, ТАК1 необходим для опосредованной рецептором ВМР активации Smad1/5/8 и экспрессии генов-мишеней BMP в хондроцитах. Ранее было продемонстрировано, что TAK 1 необходим для поддержания массы скелетных мышц у взрослых. Целенаправленная инактивация TAK1 приводит к серьезному истощению мышц, которое сопровождается повышенной активностью протеасом, повышенной аутофагией, окислительно-восстановительным дисбалансом и митохондриальной дисфункцией.

В исследовании с использованием генетических мышей и векторов, ассоциированных с аденоассоциированным вирусом серотипа 6 (AAV6), продемонстрировано, что супрафизиологическая активация TAK1 посредством влияния комплекса №24 на сверхэкспрессию белков TAK1 и TAB1 вызывает гипертрофию мышц и синтез белка. Более того, результаты показывают, что инактивация гена TAK1 приводит к нейрогенной атрофии, связанной с дегенерацией нервно-мышечного соединения (NMJ). Принудительная активация TAK1 ослабляет мышечную атрофию, вызванную денервацией, у взрослых мышей. Исследования выявило также новое взаимодействие между TAK1 и Smad1 во время нейрогенной мышечной атрофии.

Результаты. Принудительная активация TAK1 способствует гипертрофии скелетных мышц у мышей. Ранее мы сообщали, что целенаправленная индуцируемая инактивация ТАК1 приводит к истощению скелетных мышц у взрослых мышей. Однако остается неизвестным, как ТАК1 регулируется в скелетных мышцах в ответ на анаболические стимулы и достаточна ли активация ТАК1 для стимулирования роста мышц. Была использована модель двусторонней синергической абляции (SA), которая широко использовалась для индуцирования гипертрофии подошвенной мышцы. В этой модели удаление нижней части икроножной и камбаловидной мышц создает функциональную перегрузку для оставшейся подошвенной мышцы во время нормального движения мыши, что приводит к гипертрофии мышц. Анализ показал, что произошло значительное увеличение уровней фосфорилированного белка ТАК1 (р-ТАК1) в подошвенной мышце мышей дикого типа после 14 дней операции SA. Также было обнаружено значительное повышение уровней фосфорилированного р38 (р-р38), фосфорилированного Smad1/5/8 (р-Smad1/5/8), фосфорилированного Smad2 (p-Smad2) и фосфорилированного mTOR (p-mTOR) белков в подошвенной мышце на 14-й день после операции. Хирургия SA предполагает, что TAK1 активируется в сочетании с другими установленными регуляторными белками роста мышц. Также было обнаружено, что общие уровни белка ТАК1, Smad1 и Smad2 также были значительно увеличены в подошвенной мышце в ответ на функциональную перегрузку.

N-концевой киназный домен TAK1 образует комплекс с TAB1, который необходим для аутофосфорилирования TAK1 в S192 и его активации. Предыдущие исследования показали, что TAK1 не обладает киназной активностью при эктопическойэкспрессии в одиночку, но активируется при совместной экспрессии сTAB1. Чтобы понять рольTAK1 в регуляции мышечной массы, были использованы векторы AAV серотипа 6 (AAV6), имеющие конститутивный промотор цитомегаловируса (CMV), для сверхэкспрессии TAK1,TAB1 или зеленого флуоресцентного белка (GFP) в скелетных мышцах мышей. Первоначальные исследования показали, что внутримышечные инъекции примерно 1-2×1010 AAV на мышцу TA взрослых мышей приводит к экспрессии GFР в большинстве миофибрилл на 5-й день. Авторы трансдуцировали левую боковую ТА-мышцу мышей дикого типа 30 мкл раствора PBS, содержащего AAV-6-TAK1 (2,5×1010 вг) или комбинацию AAV-6-TAB1 (1,25×10 10 вг) и AAV6-TAK1 (1,25810 10 вг), в то время как в контралатеральную правую TA-мышцу вводили AAV6-GFP (2,5×1010 вг). Через 28 дней мышей подвергли эвтаназии, а мышцу ТА выделили и проанализировали с помощью морфологических и биохимических анализов. Не было никакой существенной разницы во влажной массе мышцы ТА (в норме с массой тела) которой вводили только AAV6-TAK1 или AAV6-TAB1, по сравнению с контралатеральной мышцей ТА, которой вводили AAV6-GFP. Интересно, что наблюдалось значительное увеличение влажной массы мышцы ТА, которой вводили AAV6-TAK1, так и AAV6-TAB1, по сравнению с контралатеральной мышцей ТА, которой вводили AAV6-GFP. Окрашивание гематоксилином и эозином (Н и Е) показало, что AAV6-опосредованная сверхэкспрессия GFP, TAB1, TAK1 TAK1 или TAB1 вместе не вызывали какого-либо явного фенотипа в мышцах ТА-мышей. Иммуноокрашивание срезов мышц ТА на белок ламинин с последующим количественным анализом показало, что среднее значение CSA миофибрилл было значительно выше в мышцах ТА, которым вводили AAV6-TAK1 и AAV6-TAB1, по сравнению с мышцами ТА, которым вводили только AAV6-TAK1, AAV6-TAB1 или AAV6-GFP. Кроме того, анализ показал, что доля миофибрилл с большей площадью поперечного сечения (CSA) была значительно увеличена только в мышцах ТА, которым вводили AAV6-TAK1 и AAV6-TAB1, по сравнению с мышцами ТА, которым вводили только AAV6-GFP. Не было значительного влияния на относительное распределение частоты CSA миофибрилл в мышцах ТА, которым вводили AAV6-TAK1 или AAV6-TAB1, по сравнению с контролем, введенным AAV6-GFP. В соответствии с опубликованными отчетами, авторы обнаружили, что фосфорилирование ТАК1 было резко увеличено в мышцах ТА, сверэкспрессирующих как ТАК1, так и ТАВ1, но не только ТАК1 или ТАВ1. Кроме того, окрашивание срезов мышц ТА методом трихрома Массона показало, что принудительная активация ТАК1 посредством внутримышечной инъекции AAV6-TAK1 и AAV6-TAB1 не вызывает воспаления или фиброза в скелетных мышцах. Подобно мышцам ТА, было обнаружено, что внутримышечная совместная инъекция AAV6-TAK1 и AAV6-TAB1 значительно увеличивала среднюю CSA миофибрилл, частоту миофибрилл с более высокой CSA и активацию ТАК1 в мышцах GA мышей дикого типа. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что ТАК1 активируется во время роста мышц, вызванного перегрузкой, принудительной активации ТАК1 посредством сверхэкпрессии ТАК1 и ТАВ1 достаточно, чтобы способствовать гипертрофии миофибрилл.
ТАК1 стимулирует механизм трансляции белка в скелетных мышцах.
Чтобы понять потенциальные механизмы, с помощью которых активация ТАК1 способствует гипертрофии миофибрилл, измеряли фосфорилирование различных белков, которые регулируют массу скелетных мышц. Известно, что ТАК1 активирует канонические сигнальные пути NF-Kb MAPKв клетках млекопитающих. Последовательно было обнаружено, что уровни фосфорилированного р65 (р-р65), фосфорилированного ERK1/2 (p-ERK1/2) и фосфорилированного (р-р38) MAРK были значительно увеличены в мышцахTA, сверхэкспрессирующих TAK1 и TAB1, по сравнению с контралатеральными мышцами TA, экспрессирующими GFP. Затем были измерены уровни фосфорилированных и общих белков Smad. Значительное увеличение общего уровня Smad1 и Smad2, отсутствие различий в уровнях p-Smad1/5/8 и Smad4 и незначительное снижение уровня p-Smad2 наблюдалось в мышцах TA мышей, сверхэкспрессирующих TAK1 и TAB1, по сравнению с мышцами контралатерального контроля. Напротив, не было никакой существенной разницы в фосфорилированных или общих уровнях белка Akt, mTOR или AMPK между контролем и TAK1 с избыточной экспрессией TAB1 в мышцах TA. Вестерн-блоттинг-анализ подтвердил, что уровни фосфорилированного, а также общего белка TAK1 были значительно увеличены в мышцах ТА мышей, которым вводили AAV6-TAK1 и AAV6-TAB1.

Затем авторами было исследовано фосфорилирование ключевых факторов, которые регулируют трансляцию белка во время роста скелетных мышц. Синтез белка в клетках человека и млекопитающих зависит от множества эукариотических факторов инициации трансляции (EIF), которые инициируют трансляцию. Вестерн-блот-анализ выявил значительное увеличение уровней фосфорилированного eIF4E (p-eIF4E), фосфорилированного eIF4B (p-eIF4B), и общего eIF4H, но не общего eIF4E, общегоeIF4B или eIF4А в мышцах ТА, по сравнению с контралатеральной контрольной мышей, экспрессирующих ТАК1 и ТАВ1, по сравнению с контралатеральной контрольной мышей, экспрессирующих только GFP. eIF2 является еще одним важным фактором для формирования комплекса предварительной инициации 43S, необходимого для синтеза белка. Активация eIF2 отрицательно регулируется фосфорилированием альфа-субъединицы в остатке Ser51. Было обнаружено, что уровни фосфорилированного белка eIF2a были значительно снижены в мышцах ТА, сверхэкспрессирующих ТАК1 и белок ТАИ1, по сравнению с контралатеральной контрольной мышцей. В ответ на различные анаболические стимулы mTOR фосфорилирует киназу p70S6 (p70S6K), которая, в свою очередь, фосфорилирует рибосомный белок S6 (PS6), что положительно влияет на рост мышц. В то время как было обнаружено значительное увеличение уровней фосфорилированного белка rpS6 (p-rpS6), уровни фосфорилированного белка p70S6K (p-p70S6K) оставались сопоставимыми между контролем и ТАК1, при этом ТАВ1 сверхэксперссировал мышцу ТА. В ответ на митогенные и/или стрессовые стимулы p38MAPK фосфорилируют и активируют взаимодействующие с МАРК протеинкиназы 1 и 2 (Mnk1 и 2), которые затем фосфорилируют свой основной нисходящий эффектор, eIF4E в Ser 209, чтобы инициировать трансляцию белка.Кроме того, ERK1/2 активирует p90RSK, который затем фосфорилирует rpS6 в Ser 235/236 in vitro и in vivo, используя mTOR-независимый механизм для стимуляции Cap-зависимой инициации трансляции. Было обнаружено, что уровни фосфорилированного Mnk1 (p-Mnk1), а также фосфорилированного p90RSK (p-p90RSK) были значительно увеличены в мышцах ТА, сверхэкспрессирующих TAK1 и TAB1, по сравнению с коллатеральной мышцей TA, экспрессирующейтолько GFP.

Выполняя анализ поверхностного восприятия трансляции (Su и SET) авторы также измерили скорость синтеза белка в мышцах TA мышей сверхэкспрессирующих GFP, ТАВ1, ТАК1 или комбинацию ТАК1 и ТАВ1. Результаты показали, что наблюдалось значительное увеличение синтеза белка в мышцах ТА, сверхэкспрессирующих ТАК1 и ТАВ1, по сравнению с мышцами, экспрессирующими GFP, ТАВ1 или только ТАК1. Результаты исследований также подтверждают, что уровни фосфорилированного eIF4E и rpS6 значительно повышены в мышцах ТА мышей, совместно экспрессирующих ТАК1 и ТАВ1, но нетолько ТАК1 или ТАВ1.

Принудительная активация ТАК1 стимулирует синтез белка в культивируемых миотрубках. Первичные миобласты, полученные от мышей дикого типа, дифференцировали в миотрубки путем инкубации в дифференцировочной среде в течение 72 часов. Затем миотрубки трансдуцировали AAV6-GFP или комбинацией AAV6-TAK1 и AAV6-TAB1 в течение 48 часов. Миотрубки, трансдуцированные AAV6-GFP, выглядели здоровыми. В соответствии с результатамиin vivo, наблюдалось значительное увеличение уровней p-rpS6, p-eIF4E, eIF4E, p-Mnk1,Mnk1, ERK1/2, p-p90RSKи Smad1 в ТАК1 и ТАВ1-сверхэкспрессирующих культурах по сравнению с контрольными культурами. Напротив, не было существенной разницы в уровнях р-mTOR и р-Smad1/5/8 между контрольными и ТАК1 и ТАВ1-сверхэксперссирующими культурами. Также был проведен анализ SU и SET для измерения скорости синтеза белка. Результаты показали, что скорость синтеза белка значительно увеличена в культурах, трансдуцированных только AAV6-GFP.
ТАК1 стимулирует механизм трансляции у увеличивает синтез белка в культивируемых миотрубках.

Поскольку принудительная активация ТАК1 индуцирует синтез белка, не влияя на фосфорилирование mTOR, авторы попытались исследовать, может ли ТАК1 спасти синтез белка в культивируемых при ингибировании mTOR. Культивируемые миотрубки подвергали совместной трансдукции с AAV6-TAK1 и AAV6-TAB1 или с AAV6-GFP в течение 48 часов с последующей обработкой рапамициномв течение дополнительных 24 часов. Результаты показали, что рапамицин ингибировал уровни фосфорилированного белка rpS6 и скорость синтеза белка была значительно выше в обработанных рапамицином ТАК1 и ТАВ1-сверхэкспрессирующих культурах по сравнению с соответствующими обработанными рапамицином контрольными культурами, экспрессирующими только GFP. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что принудительная активация ТАК1 (которую вызывает комплекс №24) стимулирует трансляционый механизм, независимый от mTOR.

В свою очередь, в опытах инактивация ТАК1 приводит к нарушениям NMJ и мышечной атрофии. Структурные изменения наряду с функциональными изменениями приводят к нарушению нервно-мышечного соединения (NMJ) при многих нейродегенеративных заболеваниях и старении. Ранее авторы сообщали, что целенаправленная индуцируемая инактивация ТАК1 у взрослых мышей приводит к серьезному истощению мышц и кифозу, которые напоминают возрастное истощение мышц. Используя мышечных мышей с нокаутом ТАК1, индуцируемым тамоксифеном (ТАK1mKO), авторы исследовали, играет ли ТАК1 какую-либо роль в поддержании целостности NMJ у мышей. Мышей ТАК1 (Так1fl/fl) и Tak1Mko (Tak1fl/fl, HAS-MCM), подвергнутых флоксу, лечили тамоксифеном в течение 4 дней подряд. После этого мышей кормили кормом, содержащим тамоксифен, в течение следующих 24 дней. Наконец, мышей подвергали эвтаназии, выделяли отдельные мышцы и задних конечностей и проанализировали морфологическими и биохимическими методами. В соответствии с ранее опубликованными отчетами авторов, у мышей Tak1mKO наблюдалось значительное снижение среднего CSA миофибрилл по сравнению с мышами Tak1fl/fl.

NMJ позвоночных состоит из пресинаптического нервного окончания, внутрисинаптической базальной пластинки (синаптической щели), постсинаптической специализации (моторнаяконцевая пластина мышечного волокна) и пресинаптических шванновских клеток. Авторы исследовали влияние специфичной для мышц инактивации ТАК1 на морфологию NMJ. Продольные срезы, полученные из ТА-мышцы мышей Tak1fl/fl и Tak1mKO, были окрашены конъюгированными α-bungaro-toxin Alexa 488 антителами против нейрофиламентов (NF-M) и белка синаптических пузырьков 2 (SV2) и DAPI. Компоненты NMJ были проанализированы в соответствии со стандартизованной методологией, основанной на Image-J, NMJ-morph. Авторы наблюдали грубое нарушение в постсинаптической области NMJ у мышей Tak1mKO по сравнению с однопометными мышами Tak1fl/fl. NMJ мышей Tak1mKO наблюдалась повышенная фрагментация NMJs по сравнению с мышамиTak1fl/fl. Некоторые концевые пластины в Tak1 мыши mKO были странно меньше, тогда как некоторые были крупнее, но с обширной фрагментацией. Напротив, параметры пресинаптической области, такие как диаметр аксонов, площадь нервных окончаний, средняя длина ветвей и индекс сложности, оставались сопоставимыми у мышей Таk1fl/fl и Tak1mKO.

Таким образом, целенаправленная инактивация Таk1 приводит к нарушению NMJ.
Несколько исследований показали, что повреждение нерва, денервация или синаптическая блокада приводят к увеличению синтеза ацетилхолиновых рецепторов (AChR). Поэтому авторы измерили экспрессию генов различных компонентов NMJ в скелетных мышцах мышей Таk1fl/fl и Tak1mKO. Интересно, что уровни mPHK AChRA (Chrna1), AChRB (Chrnb1), Agrin (Agrn), MuSK (Musk) и Dok7 были значительно повышены в мышцах GA мышей Tak1mKO по сравнению с мышами Tak1fl/fl, подтверждая, что инактивация TAK1 в скелетных мышцах приводит к нарушению NMJs. В отдельном эксперименте авторы также измерили уровни mPHK различных компонентов NMJ в контрольных и денервированных мышцах GA мышей. Результаты показали аналогичную повышающую регуляцию уровней mPHK AChRa (Chrna1), AChRB (Chrnb1) и Musk в денервированной мышце GA по сравнению с контралатеральной мышцей мышей дикого типа, оперированной ложным путем.

Было обнаружено, что семейство транскрипционных факторов FOXO, таких какFoxO1,3,4, индуцируют экспрессию генов различных компонентов убиквитин-протеасомной системы (UPS) и аутофагию. Сверхэкспрессия белков FoxO вызывает атрофию мышц, тогда как их ингибирование предотвращает атрофию миофибрилл при различных состояниях, включая денервацию. Авторы наблюдали значительное увеличение FoxO3 и FoxO4, но не белка FoxO1, в мышцах GA мышей Tak1mKO по сравнению с мышцами Tak1fl/fl. Затем авторы исследовали ось HDAC4-миогенин, которая является еще одним основным путем, запускающим протеолиз в денервированных мышцах. Этот путь также участвует в синаптогенезе и косвенно подавляет экспрессию молекул, участвующих в гликолизе, и корепрессоров миогенина. Результаты показали, что уровни mPHK и белка HDAC4 и миогенина (Myog) были значительно увеличены в мышцах GA мышей Tak1mKO по сравнению с мышцами Tak1fl/fl. Эти результаты согласуются с результатами авторов у мышей дикого типа, у которых аналогичная повышенная экспрессия Hdac4 иMyog наблюдалась в мышцах GA в ответ на перегрузку седалищного нерва. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что TAK1, индуцируемый пептидами комплекса №24 играет ключевую роль в поддержании гомеостаза NMJ.
В опытах, подтверждающих важность ТАК1 для роста мышц было показано, что инактивация Таk1 нарушает передачу сигналов Smad в скелетных мышцах.
Накопленные данные свидетельствуют о том, что передача сигналов Smad играет важную роль в регуляции массы скелетных мышц в условиях роста и атрофии мышц. Было обнаружено, что отрицательные регуляторы роста, такие как миостатин и активины, подавляют активацию Akt/mTOR через Smad2/3. И, наоборот, лиганды семейства BMP интегрируют Smad1 и Smad4 для положительной регуляции массы скелетных мышц, особенно в денервированных мышцах. Несколько исследований показали, что TAK1 играет роль в регуляции передачи сигналов Smad во время остеогенеза, хондрогенеза. Существует ли такое взаимодействие между сигналами TAK1 иSmadрегуляции массы скелетных мышц, ранее не исследовалось. Результаты авторов исследования показали значительное увеличение фосфорилирования как специфичного для BMP Smad1/5/8, так и специфичного для TGF-B Smad у мышей Tak1mKO по сравнению с однопометными мышами Tak1fl/fl. Авторы также наблюдали значительное увеличение уровней общего Smad1 и Smad2 в скелетных мышцах мышей Tak1mKO по сравнению с мышами Tak1fl/fl. Однако не было заметной разницы в уровнях Smad4 и Smad6.

Чтобы лучше понять механизма активации R-smads (то есть Smad1/5/8 и Smad2/3) после инактивацииTAK1в скелетных мышцах мышей, авторы измерили уровни mPHK лигандов подсемейства BMP и TGF-B и их рецепторов. Интересно, чтоALK3 (Bmpr1a), ALK6 (Bmpr1b) и Bmpr2, рецепторы, участвующие в активации осиBMP-Smad1/5/8, а также рецепторы ALK4 (Acvr1b), ALK7 (Acvr1c) и Tgfbr2, связанные с активаций плеча TGFB-Smad2/3, оказалась значительно повышена регуляция в мышцах GA мышей Tak1mKOпо сравнению с мышами Tak1fl/fl. Кроме того, наблюдалось значительное увеличение уровней mPHK Bmp4, Bmp7, Bmp8а, Bmp8b, Bmp13 (gdf6), Bmp14 (Gdf5) и Bmp15 в мышцах GA мышей Tak1mKO по сравнению с мышами Tak1fl/fl. Напротив, уровниmPHK Bmp2, Bmp3, Bm5, Bmp6, Bmp11 (Gdf11), Bmp12 (Gdf7), миостатина (Mstn), ингибина бета А (Inhba), рецепторов Acvr2a и Acvr2bоставались сопоставимыми в мышцах GA мышей Tak1fl/fl и Tak1mKO.
В опытах целенаправленная инактивация ТАК1 нарушает передачу сигналов Smad в скелетных мышцах.

ТАК1 взаимодействует с Smad1 при денервации для предотвращения чрезмерной атрофии мышц. Известно, что передача сигналов Smad, опосредованная ТАК1, зависит от типа клеток и зависит от контекста. В скелетных мышцах активация сигнальной оси Smad1/5/8 действует как компенсаторный путь для предотвращения чрезмерного истощения мышц во время денервации. Ранее авторы наблюдали, что целенаправленное удаление ТАК1 усугубляет вызванную денервацией мышечную атрофию у мышей. Основываясь на результатах авторов в исследовании, показывающих резкий дисбаланс в передаче сигналов Smad, активацию оси HDAC4-миогенин и нарушение NMJ при удалении Tak1, авторы предположили, что передача сигналовTAK1 регулирует массу скелетных мышц в ответ на денервацию. Чтобы проверить эту гипотезу, авторы сначала провели эксперимент по совместной иммунопреципитации для оценки взаимодействия между ТАК1 и белком Smad1 в деневированных скелетных мышцах мышей. Результаты показали значительное обогащение Smad1 при иммунопреципитации антителом к ТАК1. Напротив, авторы не обнаружили никакого взаимодействия между ТАК1 и Smad4 в контрольных или денервированных мышцах.
ТАК1 регулирует передачу сигналов Smad в денервированных мышцах для облегчения атрофии.

Опубликованные отчеты предполагают, что взаимодействие между ТАК1 и белком Smad точно настраивает результат передачи сигналов Smad. В денервированных мышцах лиганды ВМР связываются с их рецепторами и индуцируют фософрилирование Smad1, которое подавляет экспрессию генов различных ятрогенов. Авторы предполагают, что взаимодействие ТАК1 и Smad1 необходимо для опосредованной Smad1 профилактики чрезмерной мышечной атрофии во время денервации. Чтобы проверить эту гипотезу, мышей Таk1fl/fl и мышей Tak1mKO лечили тамоксифеном в течение четырех дней подряд для удаления гена Таk1 в скелетных мышцах, а затем мышей подвергали операции денервации. На 7-й день после денервации авторы обнаружили, что вызванная денервацией потеря мышечной массы ТА и GA (нормализованная по массе тела) была выше у мышей Tak1mKO по сравнению с мышами Tak1fl/fl. Вестерн-блот-анализ показал, что уровни MAFbx и MuRF1 были значительно выше в денервированных мышцах мышей TAk1mKO, по сравнению с соответствующими денервированными мышцами мышейTak1fl/fl. Кроме того, наблюдалось значительное увеличение относительного уровняmPHK Musal (Fbxo30)в денервированной мышце GA Tak1 мыши mKO по сравнению с денервированными мышцами Tak1мышей fl/fl. Кроме того, также наблюдалось значительне увеличение количества конъюгированных с убиквитином белков в денервировнной мышце GAмышей Tak1mKO по сравнению с мышами Tak1fl/fl. Интересно, что авторы также наблюдали значительное увеличение уровней p-Smad1/5/8 в денервированных мышцах мышей Tak1mKO по сравнению с денервированными мышцами мышей Tak1fl/fl. Напротив, не было существенной разницы в уровняхSmad1, p-Smad2, Smad4 и Smad6 между денервированными мышцами мышей Tak1mKO и Tak1fl/fl.BMP-опосредованное фосфорилирование Smad1 ограничивает экспрессиюMAFbx, MuRF1 иMUSA1 во время денервации. Результаты исследований показывают, что TAK1 способствует Smad1-опосредованному подавлению экспрессииMAFbx,MuRF1 иMUSA1.

Авторы также оценили активацию ключевых регуляторов механизма трансляции белка. Значительное увеличение уровней белка p-IF4E, p-rpS6 наблюдалось в денервированных мышцах GA по сравнению с иннервированными мышцами GAмышей Таk1fl/fl. Интересно, что инактивация TAK1 значительно уменьшала вызванное денервацией увеличение уровнейp-tIF4E, но неp-rpS6 в мышцах GA мышей. В целом, эти результаты демонстрируют, что TAK1взаимодействует с Smad1 для ингибирования экспрессии генов мышечно-специфических убиквитинлигаз Е3 и стимулирует механизм трансляции белка в скелетных мышцах.

ТАК1 регулирует субклеточное распределение белков Smad в денервированных скелетных мышцах.
В дополнение к статусу фосфорилирования R-Smads (то есть Smad1/5/8 иSmad2/3), их способность образовывать многобелковые комплексы сCo-Smad (то есть Smad4) и I-Smads ( то есть Smad6 и 7), а также субклеточное расположение комплексаSmad, влияние и определениеконечных последствий передачи сигналов Smad. Поэтому авторы изучили субклеточное распределение Smads в скелетных мышцах мышей Tak1fl/fl иTakqmKO в ответ на денервацию. Авторы измерили уровни различных белков Smad в ядерныхи цитозольных фракциях иннервированных и денервированных мышц GA мышей Tak1fl/fl и Tak1mKO. Результаты показали, что наблюдалось значительное увеличение уровней p-Smad1/5/8 в ядерной фракции денервированной мышцы GA мышей Tak1fl/fl, так и мышей Tak1mKO по сравнению с коллатеральной контрольной мышцей GA. Интересно, что авторы также обнаружили значительное увеличение уровня ядерного Smad4 в денервированной мышце GA мышей TAk1fl/fl по сравнению с иннервированной мышцей GA мышей Tak1fl/fl.
Однако такого увеличения уровней Smad4 в ядерной фракции денервированных мышщ GА мышей Tak1mKO не было заметно.

Значительно более высокие уровни Smad6 наблюдались в ядерной фракции денервированной мышцы GA мышей Tak1mKOпо сравнению с денервированной мышцей GA мышей Tak1fl/fl. Это различие в ядерномSmad6 между Tak1fl/fl и Tak1mKO также наблюдалось в иннервируемых мышцах. В цитоплазматической фракции p-Smad1/5/8 был значительно повышен в денервированной мышце GA мышей Tak1mKO по сравнению с контрольной мышцей GA. Не было заметной разницы в уровнях Smad4 в цитозольных фракциях денервированных мышц GA мышей Tak1fl/flи Tak1mKO. Соответственно, было обнаружено, что цитозольные уровниSmad6 значительно ниже в денервированной мышце GA мышей Tak1mKO по сравнению со всеми другими генотипами. Белок GAPDH присутствует как в цитоплазме, так и в ядерных экстрактах, тогда как Lamin B1 используется вкачестве регулятора нагрузки для ядерных экстрактов. Результаты авторов показали, что GADPH был обогащен цитоплазматическими экстрактами, тогда какLaminB1 был преимущественно обогащен ядерными экстрактами, что подтверждает чистоту цитоплазматических и ядерных экстрактов. Результаты исследований показывают, что ТАК1 регулирует пространственное распределение Smad1, Smad4 и Smad6 в денервированных мышцах. TAK1 поддерживает ядерную транслокацию Smad4 и цитозольное удержание белка Smad6 в денервированных мышцах.

Лиганды BMP индуцируют фосфорилирование TAK1 в скелетных мышцах. Сначала авторы измерили, как уровни некоторых ключевых лигандов BMP были затронуты в скелетных мышцах мышей Tak1fl/fl иTak1mKO в ответ на денервацию. Анализ qPCR показал, что уровни mPHK как Bmp13, так и Bmp14 были резко увеличены в скелетных мышцах во время денервации. Более того, уровни Bmp13 были значительно выше в денервированной мышце мышей Tak1mKO по сравнению с соответствующей денервированной мышцей Tak1fl/fl. Затем, авторы попытались исследовать, активируют ли BMP-лигандыTAK1 и требуется ли TAK1 для индуцированного BMР фосфорилированияSmad1/5/8 в скелетных мышцах. Первичные миобласты мыши дифференцировали в миотрубки путем инкубации в дифференцировочной среде в течение 72 часов. Затем миотрубки предварительно обрабатывали 5Z-7-оксозеанолом (5-Z7O), хорошо известным фармакологическим ингибитором ферментативной активности ТАК1 с последующим добавлением рекомбинантного белка ВМР7 или ВМР13. Вестерн-блоттинг-анализ показал, что обработка либо ВМР7, либо ВМР13 увеличивала фосфорилирование ТАК1 и Smad1/5/8 в культивируемых миотрубках. Однако индуцируемая BMР7 или ВМР13 активация p-Smad1/5/8 была значительно снижена в миотрубках, предварительно обработанных 5-Z7O. Как и ожидалось, 5-Z7O притупил фосфорилирование TAK1 в ответ наBMP7 или BMP13.

В качестве дополнительного подхода авторы также исследовали эффект нокдауна ТАК1 при индуцированной ВМР активации Smad1/5/8 в миотрубках. Первичные миотрубки мыши трансдуцировали аденовирусными конструкциями, экспрессирующими либо скремблированную короткую шпильковуюPHK (shRNA), либо Tak1 shRNA вместе с GFР. Было обнаружено, что через 48 часов уровни mPHK Tak1 резко снижаются в культурах, трансдуцированных аденовирусными конструкциями, экспрессирующими Tak1 shRNA. В параллельном эксперименте миотрубки, экспрессирующие контрольную или Tak1 shRNA, обрабатывали рекомбинантнымбелкомВМР7илиВМР13втечение30минут, и уровни p-Smad1/5/8 измеряли с помощью вестерн-блоттинга. Результаты показали, что нокдаун ТАК1 снижает индуцированное ВМР7 или ВМР13 фосфорилирование p-Smad1/5/8 в культивируемых миотрубках. Вестерн-блоттинг-анализ авторов подтвердил, что белок ТАК1 был значительно снижен в культурах, трансдуцированных Ad.shRNA TAK1. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что ТАК1 способствует передаче сигналов Smad1, индуцированных ВМР, в скелетных мышцах.

Принудительная активация ТАК1 уменьшает вызванное денервацией истощение мышц. Предыдущие результаты авторов выявили критическую регуляторную роль ТАК1 в предотвращении чрезмерной потери мышечной массы во время денервации. Чтобы дополнительно подтвердить стимулирующие рост эффекты ТАК1 и его роль в предотвращении чрезмерного истощения мышц во время нейрогенной атрофии, авторы изучили эффект принудительной активации ТАК1 при мышечной атрофии, вызванной денервацией. Мышам дикого типа вводили внутримышечную инъекцию либо AAV6-GFP (2,5×1010 вг), либо комбинации AAV6-TAK1 (1,25×1010 вг) и AAV6-TAB1 (1,25×1010 вг) в обе ТА-мышцы. После 14 дней внутримышечной инъекции AAVs на левой ноге была проведена операция по денервации, тогда как правая нога была фиктивно прооперирована. Через 7 дней или 14 дней мышей подвергли эвтаназии, а мышцу ТА выделяли и использовали для морфологического и биохимического анализа. Интересно, что избыточная экспрессия ТАК1 и ТАВ1, но не GFP, уменьшала потерю массы мышц ТА во влажном состоянии на 7-й день после денервации. Затем авторы провели иммуноокрашивание на белок дистрофин с последующим количественным определением CSA миофибрилл. Этот анализ показал, что среднее значение CSA миофибрилл было значительно выше в мышцах AAV6-TAK1 и AAV6-TAB1, которым вводили 7d-денервированную мышцу TA, по сравнению с мышцами AAV6-GFP, которым вводили 7d-денервированную TA мышцу мышей. Действительно, средн